Participación de un equipo latinoamericano en el iGEM: Producción de tela de araña recombinante en Chlamydomonas reinhardtii

Livia S Ferreira-Camargo1, João Vitor Dutra Molino1, Thiago Mosqueiro2, Viviane M Siratuti1, Miguel A Croce1, Allan E. Tanaka1, Felipe X Buson1, Pedro de Freitas Ribeiro1, A Brayan Campos-Salazar1, Eduardo A Padilha3, André Schraider Maizel1, Mireia Recio Mitter1, Raquel de Souza lima1, Claudia I S Costa1, Renan V de Araujo1, Edmar Ramos1, Tiago Lubiana Alves1, Lucas Nishida1, Fabio N de Mello1, Clarissa Reche1, Rita Wu1, Samarina R Wlodarczyk1, Victor Nunes4, Leandro F Taroso4, Cauã Westmann5, Sair Maximo Chavez-Pacheco1, Karent Romero1, Bruno R Aricó1, Gabriel S Guimarães4, Danilo Vieira1, Joao C M Carvalho1.

1 Universidad de São Paulo, Campus Cidade Universitária, São Paulo, Brasil

2 Universidad de California San Diego, Instituto de Biocircuitos, California, USA

3 Universidad Federal de São Paulo, São Paulo, Brasil

4 Universidad Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho

5 Universidad de São Paulo, Campus Riberão Preto, São Paulo, Brasil

El movimiento Do-It-Yourself Biology (DIY-Bio) converge con el nacimiento de la biología sintética, a inicio del presente siglo. Basado en el principio de ciencia ciudadana y trabajo multidisciplinar colaborativo (1, 2), DIY-Bio fomenta una cultura de pensamiento científico orientado hacia la propuesta de ideas más atrevidas y menos alineadas al “domesticado” sistema académico que prepondera (3). Aunados al desarrollo de la ingeniería biológica, esta cultura erigió en 2003 la “International Genetically Engineered Machine” (iGEM), una competencia americana anual en biología sintética. Norteamérica y Europa han comandado el trecho inicial de DIY-Bio y iGEM, mientras que las regiones del sur global, con 13 “comunidades” y menos de 30 equipos para competir, nos hemos ido adaptando. Una de las mayores restricciones que sustenta esta escasa participación es la accesibilidad a equipos y herramientas de laboratorio (4). Bajo esta premisa, el Club de Biología Sintética (SYNBIO-Brasil) propició el espacio de diálogo para el establecimiento del equipo USP_UNIFESP_UNESP, cuyo compromiso fue participar en el iGEM 2016. Uno de nuestros objetivos para la competencia buscó desarrollar una centrífuga-DIY a través del abordaje open-hardware. En términos experimentales, el proyecto exploró proteínas de tela de araña, debido a sus atractivas propiedades como resistencia a fracturas y tensiones, así como elasticidad y biocompatibilidad (5, 6). Sin embargo, hospederos como Escherichia coli presentan dificultades para expresar genes con secuencias repetitivas o de contenido alto de guanina-citosina (GC), como las de nuestro interés. Chlamydomonas reinhardtii es una microalga eucariota con un alto contenido natural de GC, además de realizar modificaciones post-traduccionales y secretar proteínas. El bajo costo de medios de cultivo, el crecimiento rápido y la estabilidad genética lo convierten en la opción más idónea como sistema de expresión (7, 8). Un nanomaterial como tela de araña, fusionado con una biomolécula ha sido reportado como una aplicación biomédica promisoria. Es así que nuestro proyecto aborda el estudio de enzibióticos, enzimas con actividad antimicrobiana específica contra bacterias multirresistentes a fármacos. De esta forma, expresar en microalga enzibióticos e inmovilizados en matrices de proteínas de tela de araña para tratar infecciones de víctimas de quemaduras representa una alternativa terapéutica innovadora. En consecuencia, nuestro objetivo primario evalúa la capacidad de producción de proteínas quiméricas de tela de araña y enzibióticos en Chlamydomonas reinhardtii. Adicionalmente, validar previamente este sistema de expresión por medio de un reportero constituye una prioridad. La metodología en detalle fue publicada en el journal RIO (9). Hasta ahora, los resultados parciales muestran: validación del constructo sintético, constituido por promotor, gen de resistencia y péptido señal, para expresión de proteínas recombinantes en microalga fue realizada por transformación nuclear, mientras que el ensamblaje de las secuencias genéticas de tela de araña están atravesando dos abordajes, clonaje por medio de excisión de uracilas, y por medio de enzimas de restricción que permitió obtener un gen de 8 monómeros. El clonaje de enzibióticos en E. coli fue insatisfactorio y demostró ser poco eficiente. Para la validación, se utilizó una proteína reportera adaptada al codon usage de la microalga, mCherry, que permitió la adquisición de datos cuantificables: cinética de crecimiento de C. reinhardtii y fluorescencia in situ y en la fracción sobrenadante del cultivo. El péptido señal en el constructo favorece la secreción de mCherry, permitiendo su purificación por cromatografía de intercambio iónica y caracterización del espectro de absorción/emisión de fluorescencia. En resumen, fue diseñada, construida y documentada la elaboración de nuestra centrífuga-DIY; validado el constructo sintético para expresión de proteínas recombinantes en C. reinhardtii, implementada una metodología de purificación de mCherry y ampliado su espectro de absorción/emisión de fluorescencia. Con todo ello, en reconocimiento del esfuerzo realizado, el equipo obtuvo una medalla de plata.

 

Descriptores: DIY-Bio, iGEM, sur global, tela de araña, microalga, enzibióticos, mCherry

 

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