Evaluación de niveles de ADN circulante en plasma (biopsia líquida) por PCR digital para diagnóstico precoz en pacientes con cáncer de mama

 

Alexis Murillo1, Jaime Ponce2, Joseph Pinto2, Jhajaira Araujo2, Alfredo Aguilar2, Carlos Vigil2, Ricardo Fujita1 y José Buleje1

1 Universidad de San Martín de Porres, Av. Alameda del Corregidor 1531, La Molina, Lima

2 Oncosalud- AUNA, Av. Guardia Civil 571, San Borja, Lima

Desde los años 50 se conoce la presencia del ADN circulante (cell free-DNA, cfDNA) en fluidos [1]. El cfDNA es producido por lisis celular en todos los órganos del cuerpo (aún en los de difícil acceso), puede ser producido en enfermedades degenerativas, tumores, infecciones o ADN fetal en gestantes [2]. Una forma de analizar cfDNAs, es mediante la técnica de PCR digital (dPCR), que detecta el incremento del ADN de una célula distinta y minoritaria entre un bagaje de miles de células. Este sistema dispersa las muestras entre veinte mil pocillos (microfluidos en chip), donde suceden reacciones de amplificación de forma independiente que luego son registradas mediante una lectora. Por supuesto, el uso del dPCR se aplica en la llamada “biopsia líquida”, la cual no es invasiva, realizada en plasma u otro fluido que contenga cfDNA y es usada para la detección temprana de carga viral, DNA tumoral, de anomalías prenatales; así como biomarcador de lupus eritematoso o artritis reumatoide [3,4]. En el Centro de Investigación en Genética y Biología Molecular de la Universidad de San Martín de Porres, estamos implementando la única plataforma dPCR en Perú y nuestro objetivo es evaluar los niveles de cfDNA tumoral en plasma de pacientes de cáncer de mama y controles sanas por dPCR. Para ello, se cuantificaron muestras de cfDNA de plasma obtenidas con el kit MagMAX™ Cell Free DNA Isolation. Con este propósito, evaluamos 2 genes (PUM1 y RNasaP) que se encuentran en mayor número de copias en el plasma de pacientes con tumores que en controles. Para la amplificación de fragmentos, se combinó master mix 1X (Applied Biosystems) y ensayos de detección por PCR de ambos genes, con 1.5 uL de cfDNA de plasma. Dichos preparados fueron dispersados en los chips y colocados en un termociclador ProFlexTM (Applied Biosystems) siguiendo el programa pre-establecido por el fabricante, con una adición de cinco ciclos. Finalmente, se obtuvieron los datos de cuantificación con QuantStudio® 3D AnalysisSuite™ Cloud Software. La comparación de la concentración de ADN en copias por microlitro y otros cálculos estadísticos fueron realizados con InfoStat 2015. Se encontraron diferencias significativas en los valores de cfDNA entre pacientes y controles para PUM1 (p=0.0001) y RNasa P (p=0.0003); estableciendo puntos de corte entre grupos en 78.995 y 51.154 copias/uL, respectivamente. Dichos valores pueden considerarse en la clasificación de grupos para el futuro análisis de muestras problema. Asimismo, se evaluó el soporte estadístico para el uso de marcadores en el diagnóstico mediante la curva ROC que favorece al marcador PUM1, con una sensibilidad del 75% y una especificidad del 95.2%. De esta forma, verificamos la utilidad de la PCR digital para la evaluación de niveles de cfDNA en plasma, donde la concentración en muestras sin diagnóstico clínico es muy baja. Esto nos permitirá extender la cuantificación de estos genes a otras neoplasias, detección de mutaciones tumor específicas, carga de patógenos y análisis prenatal. Fincyt  PIAP-3-P-1021-14.

Descriptores: biopsia líquida, PUM1, ribonucleasa P, cfDNA

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