Omar Pillaca-Pullo, Adalberto Pessoa-Jr & Michele Vitolo
1 Facultad de Ciencias Farmacéuticas – Universidad de São Paulo (Brasil), 0550-8000
Asparaginasa (EC. 3.5.1.1) es una enzima terapéutica utilizada en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda y linfomas No-Hodgkin. L-asparaginasa bacteriana es producida en gran escala, pero genera reacciones inmunes. Nuevos sistemas eucariotas son investigados para producir esta enzima. Saccharomyces cerevisiae expresa dos tipos de L-asparaginasa: intracelular y periplasmática. Algunas características como estabilidad y pH óptimo presentadas por asparaginasa II, la colocan como una alternativa importante de agente antitumoral. Por su parte, la levadura metilotrófica Pichia pastoris es una opción importante en la expresión de proteínas recombinantes controladas por el promotor AOX inducido por metanol. El control de los parámetros de cultivo (Ej. temperatura, concentraciones de inductor, tiempo de inducción, etc.) son factores importantes en la expresión de proteínas. El glicerol es el sustrato durante la fase de crecimiento mientras el metanol inicia la expresión de proteínas durante la fase de inducción. El objetivo fue determinar las mejores condiciones de inducción de P. pastoris en la expresión de L-asparaginasa a través de la aplicación de un diseño estadístico fraccionado 3k-1 de las variables: temperatura (15, 20 y 25°C), concentración de metanol (1, 2 y 3%) y tiempo de inducción (48, 72 y 96 h). Se usaron P. pastoris KM71 modificada genéticamente para expresar L-asparaginasa de S. cerevisiae, medios de cultivo BMGY (buffered glycerol-complex medium) y BMMY (buffered metanol-complex medium) y el programa STATISTICA®. Los cultivos se llevaron a cabo en frascos Erlenmeyer Baffled de 250 mL con 50 mL de medio BMGY (pH 6,0) con 10 g L-1 de glicerol a 30 °C, 250 rpm y 1 g L-1 de inóculo. Después del consumo total de glicerol, las células son separadas por centrifugación a 3500 xg y 10 °C durante 10 minutos. El pellet celular fue resuspendido en 50 mL de medio BMMY (pH 6.0). La inducción fue llevada a cabo siguiendo los parámetros establecidos por el diseño estadístico. La actividad de L-asparaginasa fue medida utilizando las células vivas en suspensión (actividad periplasmática) por el método de β-hidroxamato aspártico. En la fase de crecimiento, el glicerol fue consumido en 8 horas de cultivo y se calcularon los parámetros cinéticos de crecimiento (μmáx = 0,35 h-1 y tg = 2,0 h) y factor de conversión (Y x/s = 0,88 g.g-1). El análisis estadístico (p=0.05) determinó que la producción de L-asparaginasa presentó elevada influencia de la variable temperatura y en menor grado por el tiempo de inducción y la interacción temperatura-concentración de metanol. La expresión fue considerablemente mayor a 20°C y mejoró aumentando la concentración de metanol, mientras que el cambio en el tiempo de inducción no presentó diferencia significativa en sus diferentes niveles. En conclusión, la fase de inducción P. pastoris a 20°C con 3% de metanol durante 48 horas permite obtener la mejor producción de L-asparaginase (16 U.g-1biomasa seca).
Descriptores: Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, L-asparaginase, Metanol.