ECI 2019v: Interacción de QSOX1b (quiescina sulfidril oxidasa 1 extracelular) con proteínas de células musculares lisas de aorta para la proliferación y migración celular, Pierina Martínez (U. F. de Paraná, Brasil)

Interacción de QSOX1b (quiescina sulfidril oxidasa 1 extracelular) con proteínas de células musculares lisas de aorta para la proliferación y migración celular

Pierina Alexandra Martínez Huamaní¹, Lía Sumie Nakao¹

¹ Laboratorio Patología – REDOX, Departamento de Patología Básica, Sector de Ciencias Biológicas, Universidad Federal de Paraná, Curitiba, Brasil

Resumen

Quiescina sulfidril oxidasa 1 (QSOX1) es una flavoenzima que posee actividad tiol oxidasa, es decir, cataliza la oxidación de tioles a disulfuros, reduciendo oxigeno molecular a peróxido de hidrógeno[1]. Por ser predominantemente extracelular, su función biológica es aún poco comprendida. Se demostró que participa en el ensamblaje de la matriz extracelular con la organización de laminina y fibronectina, también puede modular la adhesión y migración de células tumorales y fibroblastos[2][3]. Nuestro grupo mostró recientemente que QSOX1 estimula la proliferación y migración de células musculares lisas de aorta (VSMC) de ratas. La proliferación es independiente de la actividad sulfidril oxidasa, mientras que la migración ocurre solamente en la presencia de QSOX1 activa[4]. En ese sentido, con la hipótesis de que QSOX1 extracelular se liga a proteínas en la superficie celular desencadenado así la señalización que lleva a estos procesos de proliferación y migración, estandarizamos condiciones experimentales para realizar un crosslinking entre la QSOX1b y proteínas de las VSMC. Utilizamos formaldehído como un agente estabilizador de los complejos de QSOX1b recombinante con sus posibles ligantes, permitiendo así la captura de la ligación de QSOX1b recombinante wild type en la membrana de las VSMC (1% formaldehído, 10 min, 37°C, 1 µM de recombinante). Detectamos por electroforesis y tinción con nitrato de plata, así como por western blot, la presencia de QSOX1b recombinante wild type en los extractos de membrana plasmática aislados de VSMC incubadas con la recombinante. Nuestros resultados mostraron que esta ligación ocurre solo en presencia de QSOX1b activa, puesto que cuando las células fueron incubadas con una recombinante mutada que no posee actividad sulfidril oxidasa, esta no fue detectada en las fracciones de membrana. La ligación a la superficie celular también fue demostrada por inmunofluorescencia indirecta, en donde VSMC en suspensión o adheridas, incubadas con QSOX1b recombinante wild type presentaron una inmuno-marcación positiva con anticuerpo anti-QSOX. Las imágenes adquiridas en el microscopio confocal mostraron una marcación intensa y diferenciada en los bordes y en el medio intracelular de las células incubadas con QSOX1b recombinante wild type, esta marcación no fue detectada en células no tratadas o tratadas con QSOX1b mutada, sugiriendo que QSOX1b extracelular puede ser incorporada por las VSMC, por un mecanismo aún incierto que depende de la actividad enzimática. En conjunto, estos datos evidencian que QSOX1b interactúa con moléculas de la superficie celular y nuestro siguiente paso será identificar estos ligantes por espectrometría de masas y caracterizar la cinética de la posible internalización de QSOX1b en las VSMC.

Descriptores: Quiescina sulfidril oxidase, célula muscular lisa vascular, cross-linking, formaldehído, superfície celular

Abstract

Quiescin/sulfhydryl oxidase 1 (QSOX1) is a flavoenzyme that possesses thiol oxidase activity, that is, it catalyzes the oxidation of thiols to disulfides, reducing molecular oxugen to hydrogen peroxide[1]. Because it is predominantly extracelullar, its biological function is poorly understood. QSOX1b was demonstrated that participates in the assembly of the extracellular matrix with the organization of laminin and fibronectin, it can also modulate the adhesion and migration of tumor cells and fibroblasts[2][3]. We recently showed that extracellular QSOX1b stimulates proliferation and migration of rat aortic smooth muscle cells (VSMC). Proliferation is independent of its sulfhydryl oxidase activity, whereas migration occurs only in the presence of active QSOX1[4]. In this context, with the hypothesis that extracelullar QSOX1 binds to a protein on the cell surface and activates signals that induces these processes of proliferation and migration, we standardized experimental conditions to carry out the crosslink between QSOX1b and VSMC proteins. We employed formaldehyde as stabilizing agent for the recombinant QSOX1b complexes with their possible ligands, thereby capturing wild-type recombinant binding on the VSMC membrane (1% formaldehyde, 10 min, 37ºC, 1 µM). We detected by electrophoresis and staining with silver nitrate, as well as by western blot, the presence of wild-type recombinant QSOX1b on plasma membrane extracts isolated from VSMC previously incubated with the recombinant. Our results showed that this ligation occurs only in the presence of active QSOX1b, when the cells were incubated with a mutated recombinant (without sulfhydryl oxidase activity), it was not detected in the membrane fractions. The ligation to the cell surface was also demonstrated by indirect immunofluorescence, where VSMC in suspensión or adhered, incubated with wild-type recombinant QSOX1b showed a positive immunostaining with anti-QSOX1 antibody. The images, acquired in a confocal microscope, showed an intense intracellular and edge staining in cells incubated with 1 µM wild-type recombinant QSOX1b, this intracellular staining was absent in cells treated with mutated QSOX1b or non-treated cells, suggesting that extracellular QSOX1b can be incorporated into VSMC, but by an unknown mechanism that depends of the enzymatic activity. Taken together, these data indicate that QSOX1 interacts with molecules present at the cell surface and our next step will be to identify these binders by mass spectrometry and characterize the kinetics of the posible internalization of QSOX1b in the VSMC.

Keywords: Quiescin-sulfhydryl oxidase, vascular smooth muscle cell, cross-linking, formaldehyde, cell surface

Referencias