ECI 2019v: Inmunoterapia anti-ROR1 en tumoesferas derivadas de la línea celular de cáncer de páncreas, PANC-1, Solange Paredes (UCL Cancer Institute, United Kingdom)

Inmunoterapia anti-ROR1 en tumoesferas derivadas de la línea celular de cáncer de páncreas, PANC-1

Solange R. Paredes-Moscosso^{1, 2}, Micaela Harrasser², Satyen Gohil², Amit C. Nathwani²

¹ Centro de Investigación de Genética y Biología Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de San Martín de Porres, Av. Alameda del Corregidor 1531, La Molina, Lima 15024, Perú

² UCL Cancer Institute, Paul O’Gorman Building, 72 Huntley St, London WC1E 6DD, United Kingdom

Resumen

Receptor tyrosine-kinase like orphan receptor (ROR1) es una proteína miembro de la familia de la tirosina quinasa. Es de resaltar que, aunque ROR1 se encuentra sobreexpresada en diversas neoplasias malignas sólidas y hematológicas, está ausente en tejido sano crítico (cerebro, corazón, hígado, entre otros). En estudios previos, nuestro grupo estableció la potente y específica destrucción que nuestra inmunoterapia anti-ROR1, bajo la forma de un anticuerpo bispecífico de células T (bispecific T-cell engager, BiTE), tiene en un rango de líneas celulares de cáncer ROR1⁺, incluyendo células de cáncer pancreático [1]. Hasta la fecha, el cáncer de páncreas (PaCa) es una de las neoplasias malignas más agresivas, pues la metástasis y la resistencia terapéutica son características inherentes a este tipo de cáncer. Las dificultades para curar dicha enfermedad se atribuyen mayormente a la presencia de células madre cancerosas (cancer stem cell-like cells, CSCs) [2]. Asimismo, cabe destacar que reportes previos indican que ROR1 está presente en la superficie celular de las CSCs de glioblastoma y cáncer de ovario [3, 4]. Por lo que, el objetivo primordial de este estudio fue investigar la capacidad del BiTE anti-ROR1 para atacar y eliminar las CSC pancreáticas ROR1⁺.
Con este fin, CSCs fueron seleccionadas in vitro empleando un ensayo de formación de esferoides y la línea celular de PaCa, PANC-1. Para corroborar la presencia de CSCs dentro de las tumoesferas generadas, éstas fueron caracterizadas a nivel genético, proteico y funcional mediante qPCR, inmunocitoquímica y ensayos de migración, respectivamente. Contrario a nuestras expectativas, se encontró que, comparadas con las células parentales (control), la expresión génica y proteica de ROR1 en las tumoesferas se había reducido, mientras que la expresión de ROR2 se había incrementado. A pesar de la reducción de ROR1, la capacidad de migración de las tumoesferas fue superior en comparación con las células control. Finalmente, ya que la expresión de ROR1 era aún detectable, se exploró la eficacia del BiTE anti-ROR1 en la viabilidad celular general y en los compartimentos ROR1⁺ de las tumoesferas. El análisis inmunocitoquímico mediante microscopía confocal confirmó la eliminación específica de las células que expresaban biomarcadores propios de CSCs y ROR1.
En conjunto, la inmunoterapia BiTE anti-ROR1, parece no solo atacar a las células ROR1⁺ presentes en la masa del tumor, sino que, elimina también los subgrupos de CSC ROR1⁺ en PaCa. Aunque la reducción de ROR1 seguida del incremento de la expresión de ROR2 se ha descrito en melanoma bajo condiciones hipóxicas [5]; este es, a nuestro entender, el primer reporte donde ambos receptores se estudian en el contexto de células madre de PaCa. Más aún, nuestros resultados proponen que la sobreexpresión de ROR2 podría estar superando el rol habitual de ROR1 en las CSC de PaCa y podría explicar el aumento de la capacidad de migración de las tumoesferas. Más estudios preclínicos y clínicos revelarán, en última instancia, el verdadero potencial terapéutico de los ROR1 BiTE solos y en combinación con otras terapias.

Descriptores: células madre de cáncer, BiTE, cultivo celular, PANC-1, ROR1

Abstract

Receptor tyrosine-kinase like orphan receptor (ROR1) is a member of the tyrosine kinase family. Importantly, ROR1 is absent in healthy, critical tissue but overexpressed in various solid and haematological malignancies. Our group has already established the potent and specific killing that our ROR1 BiTE therapy has on a range of ROR1⁺ solid cancer cell lines both in vitro and in vivo, including pancreatic cancer cells [1]. To date, pancreatic cancer (PaCa) is one of the most aggressive malignancies, where metastasis and therapeutic resistance are hallmarks of the disease. The difficulties in curing PaCa are attributed to the presence of cancer stem-cell like cells (CSC) [2]. Importantly, some reports indicate that ROR1 is also present on the cell surface of CSCs of glioblastoma and ovarian cancer [3, 4]. Thus, the overriding aim of this study was to investigate our ROR1 BiTE’s ability to target and eliminate ROR1⁺ pancreatic CSCs.
To this end, CSCs were selected using an in vitro spheroid formation assay using a pancreatic cancer cell line, PANC-1. To corroborate the presence of an enriched CSC population within the generated tumourspheres, gene, protein and functional characterisation was performed by qPCR, immunocytochemistry and migration assays, respectively. Contrary to previous assumptions, we found that ROR1 gene and protein expression was downregulated on PaCa tumourspheres compared to adherent cells; and instead, ROR2 expression was found to be upregulated. In spite of ROR1 downregulation, migration ability of tumourspheres was superior compared to parental cells. Finally, the efficacy of the ROR1 BiTE therapy on general cell viability and on specific ROR1⁺ compartments within the tumourspheres was explored as ROR1 expression, although reduced, was still detectable. Immunocytochemistry analysis by confocal microscopy confirmed specific elimination of cells expressing both CSC biomarkers and ROR1.
As a whole, ROR1 MAb-based immunotherapy, particularly using BiTEs, seems to not only target ROR1⁺ cells present in the bulk of the tumour but, crucially, it also eliminates ROR1⁺ CSC subsets in PaCa. Although ROR1 downregulation followed by ROR2 upregulation has been described in melanoma under hypoxic hypoxic conditions [5]; this is, to our knowledge, the first time both receptors are studied in the context of pancreatic cancer stem cells. Furthermore, it is proposed that overexpression of ROR2 might be overtaking the usual role of ROR1 on PaCa CSCs and might explain the increased migration capability of tumourspheres compared to parental cells. Therefore, this approach represents a relevant and much needed addition to the current options for cancer treatment. Further preclinical and clinical studies will ultimately reveal the true therapeutic potential of ROR1 BiTEs alone and in combination.

Keywords: cancer stem cell, BiTE, cell culture, PANC-1, ROR1

 Referencias